Seputar Paten Gen HARDY

Oleh: Kurniawan Rudy Trijatmiko
(Penulis adalah staf peneliti BB Biogen, salah seorang anggota tim penemu untuk paten gen toleran cekaman kekeringan. Simak halaman a Transgenic Plant Having Enhanced Drought Tolerance untuk deskripsi selengkapnya)

Pada tanaman, penyingkapan fungsi gen dengan pendekatan “forward genetics” (dari fenotipe ke sekuen gen yang bertanggung jawab) bisa ditempuh melalui dua strategi: “map-based cloning” atau “mutant analysis”. Strategi “map-based cloning” biasanya didahului dengan pemetaan genetik kasar (jarak antar marka sekitar 15-20 cM). Setelah posisi relatif sebuah gen dalam kromosom berhasil diidentifikasi, dilanjutkan dengan pemetaan halus dengan menggunakan NILs (“Nearly Isogenic Lines”) dengan menerapkan densitas marka yang lebih rapat pada daerah target. Tujuannya untuk mempersempit wilayah pencarian gen tersebut.



Sebagai gambaran, pada padi secara rata- rata jarak genetik 1 cM setara dengan jarak fisik 250 kb. Dengan pengandaian jarak antar gen 10 kb, dalam wilayah seluas 1 cM terdapat sekitar 25 gen kandidat. Untuk padi, perjalanan mempersempit wilayah pencarian gen ini terfasilitasi dengan tersedianya ribuan marka SSR beserta posisinya dalam genom yang bisa dilihat di database gramene (www.gramene.org).

Pada kasus di mana SSR polimorfik tidak lagi tersedia pada wilayah yang sudah semakin sempit, peneliti bisa mendesain primer untuk mendeteksi SNP pada wilayah tersebut. Dengan menggunakan ukuran populasi NIL yang besar akan memperbesar peluang untuk mendapatkan NIL-NIL rekombinan yang ketika dikombinasikan dengan data fenotipe memungkinkan identifikasi “breaking points” yang mengapit sekuen gen target pada wilayah sesempit 20 kb. Anotasi lengkap genom padi yang bisa diakses publik (http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/) menjamin kemudahan dalam identifikasi fungsi putatif dari sekuen gen yang diidentifikasi. Salah satu contoh penggunaan strategi “map-based cloning” ini adalah kloning gen xa5 yang menyandi subunit gamma dari faktor transkripsi umum TFIIA (Iyer and McCouch, 2004).

Strategi “mutant analysis” didahului dengan skrining koleksi mutan yang besar untuk fenotipe target. Untuk kemudahan identifikasi sekuen gen yang bertanggung jawab lebih disukai untuk menggunakan mutan-mutan “insertional disruption” yang dibuat dengan mutagen biologi (T-DNA atau transposon) karena sekuen DNA yang digunakan sebagai mutagen bisa dijadikan sebagai “tag”. Mutan-mutan yang dibuat dengan mutagen kimia atau fisik (EMS, sinar gamma, fast neutron) lebih cocok untuk digunakan dalam pendekatan “reverse genetics” (dari sekuen gen ke mutan dan fenotipe) dengan memanfaatkan teknik TILLING (McCallum et al., 2000).

Ketika mutan dengan fenotipe target diperoleh, dilanjutkan dengan isolasi fragmen DNA inang yang mengapit sekuen mutagen menggunakan teknik-teknik seperti TAIL-PCR, inverse PCR, atau adapter PCR. Selanjutnya fragmen DNA inang ini disekuen untuk mengetahui letak menyisipnya sekuen mutagen dalam genom inang. Dengan tersedianya sekuen genom lengkap beserta anotasinya pada Arabidopsis (www.arabidopsis.org) dan padi (http://rgp.dna.affrc.go.jp/IRGSP/, http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/) memudahkan untuk identifikasi gen yang tersisipi mutagen biologi yang digunakan. Bukti konklusif diperoleh melalui uji komplementasi fungsional dengan transformasi gen tipe liar ke tanaman mutan untuk melihat apakah fenotipenya benar-benar kembali ke tipe liar. Salah satu contoh penggunaan strategi “mutant analysis” ini adalah isolasi gen MALE STERILITY 2 pada Arabidopsis hasil penelitian kelompok Genome Analysis di Plant Research International, Wageningen (Aarts et al., 1993).

Namun beberapa penelitian pada Arabidopsis menunjukkan bahwa fungsi dari sebagian besar gen tidak dapat disingkapkan dengan hanya menggunakan pendekatan “loss-of-function” ini. Hal ini terutama disebabkan oleh frekuensi yang tinggi dari gen (sekitar 2/3 dari jumlah gen total) yang merupakan duplikat dan jadi tidak menunjukkan fenotipe mutan kecuali jika gen-gen duplikat dimutasi juga. Di pihak lain, “activation tagging” menggunakan pendekatan “gain-of-function” sudah sangat produktif dalam menunjukkan fenotipe mutan dari gen-gen duplikat atau gen-gen yang memiliki efek kecil ketika dimutasi dengan “insertional disruption”.

Secara singkat “activation tagging” menerapkan penggunakan 4 ulangan elemen enhancer dari promoter CaMV 35S yang ditempatkan dalam T-DNA atau transposon yang berfungsi sebagai pembawa (“carrier”). Selanjutnya T-DNA atau transposon ini ditransformasi ke jaringan tanaman, dan apabila terintegrasi ke lokasi tertentu dalam genom maka 4 ulangan enhancer tadi akan mengaktifkan ekspresi dari gen yang berada di dekatnya. Ekspresi yang meningkat dari gen ini akan menghasilkan fenotipe yang bisa diamati. Koleksi mutan “activation tag” ini selanjutnya digunakan untuk skrining fenotipe target. Proses isolasi gen sama seperti pada mutan “insertional disruption”. Hanya untuk tahap konfirmasi, dilakukan transformasi konstruk gen dengan promoter 35S ke tanaman tipe liar, untuk dilihat apakah fenotipenya sama seperti tanaman mutan “activation tag”.

Setelah keberhasilannya dalam mengembangkan populasi mutan “insertional disruption” pada Arabidopsis, kelompok Genome Analysis PRI yang dipimpin oleh Dr. Andy Pereira mengembangkan juga populasi mutan “activation tag” (Marsch-Martinez et al., 2002). Gen pertama yang berhasil diisolasi dari populasi ini adalah gen SHN1 yang menyandi faktor transkripsi AP2/ERF yang meregulasi biosintesis cutin (Aharoni et al., 2004; Broun et al., 2004; Kannangara et al, 2007). Namun proses publikasi paper dan aplikasi paten gen ini bersaing ketat dengan kelompok Mendel Biotechnology di US. Gen kedua yang berhasil diisolasi adalah gen BOLITA yang menyandi faktor transkripsi AP2/ERF yang berperanan dalam perkembangan (Marsch-Martinez et al., 2007). Gen ketiga adalah gen GARGOYLE yang menyandi faktor transkripsi Zinc Finger yang meregulasi biosintesis lignin. Gen ini sudah dipatenkan juga (Aharoni and Pereira, unpublished).

Koleksi mutan “activation tag” tersebut juga diskrining untuk toleransi terhadap kekeringan, dan ditemukan lima mutan yang menunjukkan respon toleran pada kondisi kekeringan yang parah. Salah satu di antaranya adalah mutan yang diberi nama hardy (hrd) untuk menggambarkan fenotipenya yang kokoh. Mutan ini memiliki daun yang lebih tebal dan berwarna hijau gelap, dengan struktur tanaman yang lebih kompak dan kecil dibanding tipe liar. Tanaman mutan lebih sulit dicabut dari tanah, barangkali karena akar lateral yang lebih ekstensif. Dengan teknik TAIL-PCR yang dilanjutkan sekuensing diketahui bahwa elemen transposon menyisip di dekat sebuah gen yang menyandi faktor transkripsi yang termasuk famili AP2/ERF grup IIIb, kerabat dekat DREB1 yang termasuk dalam grup IIIc. Overekspresi gen HRD di bawah kendali promoter 35S menunjukkan fenotipe yang sama dengan mutan “activation tag”, meskipun dampak fenotipenya lebih berat.

Ukuran tanaman yang kecil memunculkan pertanyaan “confounding effect” dari biomassa pada respon toleran kekeringan. Untuk menjawab pertanyaan ini dibuat konstruk overekspresi kondisional dari HRD dengan memfusikan HRD ke “glucocorticoid receptor” (GR), sehingga gen hanya akan terekspresi ketika tanaman diberi hormon steroid dexamethasone (DEX). Tanaman overekspresor fusi HRD-GR ini dibiarkan tumbuh normal sampai menjelang perlakukan kekeringan. Sampai saat itu biomassa overekpresor dan tipe liar sama. Kemudian ekspresi HRD diinduksi dengan pemberian hormon DEX, dan kedua tanaman dihadapkan pada perlakuan kekeringan. Tanaman overekpresor HRD-GR menunjukkan respon toleran kekeringan yang lebih baik dibanding tipe liar, menunjukkan bahwa overekspresi gen ini benar-benar memberikan toleransi keringan. Overekspresi gen HRD juga memperbaiki toleransi terhadap salinitas dan ketahanan terhadap patogen Verticillium.

Analisis microarray dari mutan hrd menunjukkan ekspresi diferensial dari sekelompok gen yang berbeda dari DREB1A, yang mengindikasikan mekanisme yang berbeda dalam memberikan toleransi kekeringan antara dua gen ini.

Untuk validasi fungsi gen ini, konstruk overekspresi HRD ditransformasi ke tanaman padi. Tanaman padi transgenik diuji respon toleransinya di Bangalore Agricultural University India, dan menunjukkan lebih toleran terhadap kekeringan dibanding tipe liar.

B. Kiat keberhasilan

Principal Investigator” dari penelitian ini adalah Dr. Andy Pereira, yang pada tahun 1985 mempublikasikan hasil penelitian PhD-nya tentang karakterisasi molekuler elemen transposon En/I. Sebagai anak rohani Paterson dari Iowa (penemu En/I), namanya bisa disejajarkan dengan Nina Fedorof, anak rohani Barbara McClintock (penemu Ac/Ds), yang mempublikasikan karakterisasi molekuler elemen transposon Ac/Ds pada tahun 1984. Hanya pada perjalanan karir selanjutnya Nina lebih berminat pada biologi dari transposon, sementara Andy lebih tertarik untuk aplikasinya dalam isolasi gen. Setelah menyelesaikan training postdoc di Max Planc Institute Jerman (tempat yang sama dia melakukan riset PhD-nya), Andy menjadi staf peneliti di CPRO-DLO (sekarang PRI) Wageningen. Di lembaga ini dia mengembangkan mesin kloning gen pada Arabidopsis dan padi.

Inventor pertama dari gen ini (Asaph Aharoni) pada saat itu mahasiswa PhD di kelompok Metabolomics dan Proteomics PRI yang sedang menulis thesis, tapi sudah mendapatkan posisi postdoc di kelompok Andy. Sebagai mahasiswa PhD dia sudah mempublikasikan beberapa paper di beberapa jurnal berbobot seperti Plant Cell dan Plant Journal dan menjadi inventor pertama dari beberapa paten yang diaplikasikan oleh PRI.

Satu ciri mencolok dari kelompok Andy adalah kerjasama tim yang baik dan kerelaan setiap anggota tim yang sudah menguasai suatu topik untuk mengajari anggota tim pemula. Demikian penulis belajar banyak dari Asaph dan beberapa senior yang lain. Penulis sendiri juga mengajari mahasiswa PhD yang lebih yunior (Shital Dixit, inventor kedua).

Peranan Asaph dalam penelitian ini adalah dalam skrining mutan, isolasi gen, dan karakterisasi morfologi dan histologi mutan. Shital memiliki peranan dalam pengujian toleransi kekeringan dan salinitas, begitu juga transformasi konstruk overekspresi ke Arabidopsis. Peranan penulis dalam penelitian ini adalah dalam pembuatan konstruk overekspresi HRD dan HRD-GR, analisis microarray, dan transformasi konstruk ke padi.

C. Peluang di BB Biogen

Saat ini BB Biogen sedang merintis pengembangan populasi “activation tag” pada padi. Upaya ini dikerjakan oleh sebuah kelompok yang beranggotakan penulis sendiri, Dr. Toto Hadiarto (lulusan PhD dari Osaka University dengan topik penelitian protein kinase), Atmitri Sisharmini Msi, Wening Enggarini Msi, Tri Joko Santoso Msi, Tasliah Msi, Aniversari Apriana Ssi, dibantu oleh beberapa teknisi berpengalaman seperti Heri Hersusatio, Nuryati, Masumah, dan Syarif. Dr. Sugiono M. merupakan peneliti senior dalam kelompok ini.  

Ada dua proyek yang sedang dikerjakan oleh kelompok ini. Proyek pertama adalah proyek RUTI kerjasama dengan Dr. Satya Nugroho dari Biotek LIPI untuk pengembangan populasi “activation tag” padi cv. Nipponbare (temperate japonica) yang arahnya untuk isolasi gen toleransi kekeringan. Proyek kedua adalah proyek APBN untuk pengembangan populasi “activation tag” padi cv. Asemandi (tropical japonica) yang arahnya untuk isolasi gen ketahanan penyakit. Kegiatan lain dalam proyek APBN ini adalah pendekatan “reverse genetics” menggunakan strategi “positional candidate gene” untuk isolasi gen ketahanan penyakit.

Karena sistem penelitian di Indonesia belum semapan di negara-negara maju, dibutuhkan upaya yang jauh lebih keras untuk bisa meraih keberhasilan. Namun dengan ambisi yang cukup dan kerjasama tim yang kuat, disertai dengan dukungan dana yang kontinyu, diyakini bahwa upaya ini nantinya bisa menghasilkan sesuatu yang bermanfaat bagi lembaga.

Badan Litbang Bioteknologi & Sumberdaya Genetik Pertanian, Kampus Penelitian Pertanian, Cimanggu, Kota Bogor

BB Biogen

Badan Litbang Bioteknologi & Sumberdaya Genetik Pertanian, Kampus Penelitian Pertanian, Cimanggu, Kota Bogor

instagram takipçi hilesi hacklink c99 shell Google