Mengenal Agrobacterium tumefaciens dan Interaksinya dengan Tanaman Inang (1)

Agrobacterium dikenal sebagai bakteri saprofit tanah dan hidup di sekitar rizofir. Ada 4 spesies sebagai penyebab penyakit : tumor “crown gall” oleh A. tumefaciens, “hairy root” oleh A. rhizogenes dan “cane gall” oleh A. rubi serta “tumor dan nekrotis” oleh A. vitis. Spesies virulen mampu menginfeksi ratusan spesies tanaman terutama kelompok dikotil berkayu dan herbaceous meskipun ada beberapa monokotil juga. Bakteri A. tumefaciens, pertama kali dipelajari tahun 1853 sebagai penyakit neoplastic, selanjutnya tahun 1897 ditemukan penyakit crown gall pada anggur oleh Bacillus ampelopsore dan selanjutnya bakteri ini diduga sebagai Bacterium tumefaciens.  Bakteri ini diduga sebagai anggota Schizomycete, bersifat motil, aerobic dan mampu memanfaatkan semua jenis gula sebagai sumber makanan seperti pada standar media agar potato/peptone. Bakteri ini memiliki berkoloni yang kecil, bembulat, padat dengan permukaan halus pada suhu 25 oC. Setelah bertahun-tahun baru diketahui proses terjadinya tumor melalui oncogenesis.  Pemanfaatan A. tumefaciens sebagai alat transformasi didasarkan atas siklus hidupnya sebagai pathogen saprofit pada tanaman yang diinfeksinya (Gambar 1).


Gambar 1. Siklus hidup A. tumefaciens (Agrios, 1988)

Saat di sekitar tanaman (inang) ditemukan ada luka, bakteri akan bergerak mendekat secara kemotaksis dan menembus disela-sela sel inang. Tahap selanjutnya terjadi induksi pembelahan sel tanaman secara cepat dan tidak teratur. Pembelahan sel ini dipicu oleh adanya insersi DNA bakteri kedalam kromosom sel inang dan menyebabkan produksi sitokinin dan auksin yang berlebihan serta senyawa opine yang digunakan sebagai penyedian nutrient bagi bakteri.  Pembelah sel jaringan tanaman yang terinfeksi akan berjalan terus menerus dan terbentuk tumor di sekitar bagian tanaman yang terluka. Jaringan tumor yang rawan menyebabkan rentan terhadap infeksi pathogen sekunder, dan serangan insek. Akibat degradasi patogen skunder menyababkan tumor menjadi berwarna coklat atau hitam dan A. tumefaciens kembali dilepas ke tanah dan akan terbawa air atau tanah menyebabkan munculnnya siklus berikutnya.

Agrobacterium tumefaciens dan tumorogenesis

Bakteri A. tumefaciens adalah bakteri tanah yang mampu menginfeksi berbagai tanaman berbeda dibandingkan bakteri patogen lainnya. Bakteri ini menyebabkan perubahan secara fisiologi pada jaringan yang terinfeksi sehingga kambium tidak berkembang membentuk phloem dan xylem secara normal sehingga transport air dan nutrisi terganggu. Sebagai konsekuensinya, penyakit ini menyebabkan pertumbuhan terhambat dan hasil berkurang dan akhirnya tanaman mati. Perkembangan penyakit tumor Agrobacterium (patogenesis) melibatkan 2 proses: transformasi dan tumorigenesis.

Secara alami, Agrobacterium mampu mengenal molekul signal seperti senyawa fenolik (acetosyringone, hydroxyl-acetosyringone) dan senyawa gula yang dilepas oleh jaringan tanaman terluka. Signal ini menyebabkan bakteri bergerak menuju jaringan luka. Pergerakan A. tumefaciens bertujuan untuk mengadakan proliferasi sel inang dan sebagai mesin replikasi DNA di tempat luka. Pembentukan tumor pada tempat luka terjadi setelah beberapa hari dan terjadi integrasi T-DNA ke dalam genom tanaman yang membawa 2 set gen. gen oncogenic primer (iaaM, iaaH dan ipt) dan sekunder (6b and 5) yang mengkode enzyme dalam sintesis zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin tanaman. Saat terjadi proses tumorigenesis, enzim oncogenes T-DNA terlibat dalam sintesis opine. Senyawa hasil kondensasi dari asam amino dan gula digunakan untuk kebutuhan Agrobacterium dalam sel tumor berupa karbon dan sumber nitrogen.

Interaksi A. tumefaciens dengan sel inang

Sejak beberapa dekade, teknologi transformasi tanaman melalui A. tumefaciens telah menjadi prosedur rutin di laboratorium-laboratorium rekayasa genetik tanaman.  Meskipun demikian, misteri interaksi antara A. tumefaciens dan sel inang masih belum terungkap sepenuhnya.

Interaksi Agrobacterium tumefaciens dengan sel inang terjadi setelah mendapat signal berupa senyawa tertentu dari luka baru yang menyebabkan terjadi pengenalan terhadap inang dan pengelolaan fragmen T-DNA yang akan ditransfer.
Penempelan A. tumefaciens pada tanaman

Agrobacterium tumefaciens adalah organisme motil dengan dilengkapi flagella peritrichous, sangat sensitive dan bergerak secara kemotaksis sebagai tanggap terhadap sejumlah gula dan asam amino. percobaan mutan A. tumefaciens menyebabkan motalitas berkurang tetapi tetap virulen bila diinokulasikan secara langsung. Senyawa fenolik seperti acetosyringone teridentifikasi sangat kuat sebagai inducer gen vir. Berdasarkan beberapa laporan bahwa kemotaksis menuju senyawa acetosyringone membutuhkan plasmid Ti terutama gen regulator virA dan virG. Penempelan A. tumefaciens pada sel tanaman diduga tampak membutuhkan adanya partisipasi reseptor spesifik. Sejumlah gen yang berperan pada proses penempelan bakteri ke sel inang dipengaruhi oleh fungsi gen yang berada pada kromosom bakteri. Beberapa gen virulen kromosom diantaranya gen chvA, chvB dan pscA (exoC).

Gen-gen tersebut terlibat dalam proses pembentukan senyawa cyclic β-1,2-glucan yang terkait dengan penempelan bakteri ke sel tanam. Mutasi gen chvA, chvB dan pscA (exoC) menyebabkan penurunan 10 kali lipat dalam proses penempelan bakteri pada sel mesofil dan virulensi. Protein ChvB dipercaya terlibat dalam sintesis cyclic β -1,2-glucan. Sedangkan protein ChvA homolog dengan ATPase pengikat membran dan berfungsi dalam eksport cyclic β -1,2-glucan dari sitoplasma sampai periplasma dan cairan ekstraseluler. Percobaan virulensi mutan chvB sangat sensitif terhadap temperature, pada temperature rendah (16 oC) mutan chvB menjadi virulen dan mampu menyebabkan penempelan pada akar tanaman.

Penempelan bakteri pada sel tanaman diduga melibatkan 2 tahap proses. Tahap pertama, longgar dan reversible karena ikatan bakteri mudah dicuci. Gen yang terlibat pada tahap ini diidentifikasi berada pada daerah gen att (ukuran lebih 20 kb) pada kromosom bakteri. Mutasi gen menyebabkan hilang virulensinya. Mutan pada gen att dapat dibagi 2 group. Group pertama dapat dipulihkan penempelan dan virulensinya bila media dikondisikan. Group kedua tidak dipengaruhi oleh medium yang dikondisikan, tetapi melalui perubahan sintesis molekul permukaan yang akan berperan dalam penempelan bakteri pada inang. Tahap kedua, daya penempelan tidak dapat dirubah. Tahap ini membutuhkan sintesa serat selulose bakteri yang biasanya diambil dari permukaan luka, tetapi bila tidak ada cellulose maka akan kehilangan virulensinya.  Gen yang terlibat ini diidentifikasi terdapat pada kromosom bakteri tetapi tidak ada kaitannya dgn gen att.

Selain faktor bakteri, beberapa faktor tanaman juga penting dalam penempelan A. tumefaciens pada sel tanaman. Dua protein sel dinding tanaman: protein vitronectin-like dan protein binding rhicadhesin. Mutan A. tumefaciens yang mengalami mutasi pada chvB, pscA dan att menunjukkan pengurangan kemampuan mengikat senyawa vitronectin, sehingga senyawa ini digunakan sebagai mediasi dalam transformasi Agrobacterium.

Signal senyawa tanaman dan induksi operon vir

Beberapa gen di daerah vir pada T-plasmid terlibat dalam proses terjadi transfer fragmen T-DNA sebagai operon (gen) yaitu virA, virB, virC, virD, virE dan virG serta 2 operon yang kurang penting (virF dan virH) mengkode sekitar 25 protein terekspresi oleh adanya signal senyawa fenolik dari inang dan terkombinasi oleh monosakarida dengan pH asam (5-5.8). Protein-protein tersebut disebut sebagai protein virulensi (VIR) dan dibutuhkan merespon signal molekul tanaman dan terlibat proses transfer dan integrasi T-DNA dalam genom tanaman. Seluruh daerah vir  Pengendali utama daerah vir adalah protein VirA dan VirG dari operon virA dan virG  (Gambar 2).


Gambar 2. Interaksi Agrobacterium-tanaman melalui signal luka (Pitzschke and Hirt 2010)

Peran induksi luka tanaman pada eksprsi operon vir dibuktikan melalui co-kultivasi A. tumefaciens dgn mesofil protoplas. Penelitian yang dilakukan menggunakan sel/akar tembakau membuktikan bahwa ekspresi operon vir dipenguruhi oleh adanya senyawa fenolik sejenis asetosiringon dan hydroksi-asetisiringon yang terlibat dalam pembentukan lignin dalam polimer dinding sel tanaman. Peneliti lain menunjukkan adanya senyawa lain terlibat dalam tahap ini, seperti adanya monosakarida aldose, fosfat rendah dan kondisi pH rendah.

Bersambung……

instagram takipçi hilesi hacklink c99 shell Google